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活细胞成像:ASAP1直接影响细胞迁移机制

  

ASAP1调节以F-actin为基础的结构和功能,比如定点粘附性(focal adhesions, FAs,质膜折皱(circular dorsal rufflesCDRs),细胞伸展和迁移。ASAP1需要N端的BAR基团发挥作用。美国的科学家发现nonmuscle myosin 2A(NM2A)在体外实验中与ASAP1BAR-PH串联体直接结合。科学家用co-IP的方法在细胞内定位了ASAP1NM2A发现,如果下调ASAP1将会减少细胞内NM2AF-actin,并且会对细胞迁移,FAs,细胞伸展和CDRs都造成影响。
本实验中,将NIH3T3成纤维细胞种在腔室载玻片中,并在一天后,采用固定时间间隔连续拍照的方式在采集结果,并且分析细胞迁移的轨迹。一般NM2A激活后,会抑制细胞迁移能力。在用siRNA下调NM2AASAP1的细胞的迁移能力有显著的提升。
 
J Biol Chem. 2016 Apr 1;291(14):7517-26. doi: 10.1074/jbc.M115.701292. Epub 2016 Feb 17
The Arf GTPase-activating Protein, ASAP1, Binds Nonmuscle Myosin 2A to Control Remodeling of the Actomyosin Network..
Chen PW, Jian X, Heissler SM, Le K, Luo R, Jenkins LM, Nagy A, Moss J, Sellers JR, Randazzo PA
一、实验材料
1)细胞: NIH3T3    
2)试剂: fibronectin10 μg/ml, Calbiochem
          无酚红DMEM培养基
          双抗
3)培养耗材:µ-Slide 8孔腔室载玻片,ibiTreat底部处理 (威尼斯432888camGermany80826

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二、实验方法
一)载玻片包被
① 每孔加入300μ的  10 μg/mlfibronectin溶液
② 室温孵育60分钟
③ 吸除所有液体并小心用PBS冲洗5-10分钟,即可开始使用
二)细胞迁移实验
1)铺细胞,每孔铺约10000个细胞,过夜培养
2)置于倒置显微镜上,用20X倍镜观察
3)8分钟采集一张图片,持续5.5-6.5个小时
4)使用ImageJ分析细胞迁移轨迹。
 
 
三、实验结果
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如图所示,下调ASAP1NM2A后,细胞迁移的距离和迁移的速度都有显著的增长。
 

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